奥地利维也纳兽医大学Iwan Anton Burgener团队在《Journal of visualized experiments》 期刊发表最新推敲效果，刻画了一种从措施基质包埋的类器官培养物中生成尖端向外肠类器官的有计算，并详尽了随后将胸苷访佛物5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶（EdU）掺入活跃增殖的细胞中以及EdU阳性细胞的半自动定量。

著作先容

题目：尖端向外肠类器官的生成和EdU象征类器官增殖率的评估 杂志：Journal of visualized experiments 影响因子：1.2 发表时刻：2025年3月伸开剩余93%

#1

推敲配景

Background

本文刻画了通过水凝胶包埋肠说念类器官培养物生成尖端向外肠类器官的荡漾培养物，并诞生了用于相比的基底向外肠类器官培养物。

推敲中，尖端向外和基底向外肠类器官露出于EdU，该化合物在细胞分裂的S期会整合到新合成的DNA中。这一过程不错通过激光扫描共聚焦显微镜进行可视化，并讹诈图像分析软件半自动定量Hoechst33342和EdU象征的细胞，从而计较EdU阳性细胞在总细胞中的比例。

这种方法不仅适用于肠说念类器官的增殖分析，还不错用于其他类器官或二维细胞培养物的细胞增殖推敲。

#2

推敲念念路

Methods

诞生肠说念类器官培养体系 指导极性回转 EdU象征细胞增殖 相比尖端向外和基底向外类器官 图像分析与数据惩处

#3

推敲遐想：

Design

使命历程包括类器官培养、极性回转指导与EdU象征、Click-it EdU染色响应和Hoechst 33342染色、半自动图像分析、类器官增殖率的测定。

#4

代表性限定

Results

期许的类器官大小应在50-250 μm之间（图1A），过大的类器官可能无法灵验地回转极性，并可能初始出芽，影响极性回转。在形状学上，基底向外类器官和尖端向外类器官有显豁区别。

基底向外类器官保抓较大的腔室（图1B），而尖端向外类器官则更紧凑（图1C），且周围荡漾着牺牲细胞，这些牺牲细胞是由尖端向外类器官排出到培养基中的。相较之下，基底向外类器官在腔内累积牺牲细胞。

图1 极性逆转指导前后的类器官形状。(A) 胰酶消化后的肠类器官细胞在滋长培养基中培养3天后酿成的基质包埋态。(B) 悬浮培养3天后酿成的基底向外类器官。(C) 在不添加BME基质的悬浮培养体系中培养3天指导酿成的顶膜向外类器官（极性逆转态）。比例尺=200 μm。

在细胞增殖分析方面，使用EdU象征新合成的DNA后，基底向外类器官在时刻推移中推崇出更高的EdU信号（图2）。但是，并非总计类器官王人有EdU+细胞，部分类器官在特定成像层中可能不炫耀EdU+信号。

图2 EdU象征的基底向外与尖端向外肠类器官。上图炫耀基底向外类器官随时刻变化的共聚焦图像，在一样时间点下，其EdU阳性细胞数目显贵多于下图所示的尖端向外类器官。比例尺=100 μm。

通过图像分析软件，类器官最初被圈出（图3A），然后摒除不关系的区域（图3B）。接着自动分析历程对细胞核进行分割，分裂Hoechst33342+和EdU+细胞核，同期摒除小于15 μm²的细胞核（图3C）。

图3 EdU染色肠类器官的定量图像分析限定。（A）接收球形及多边形模式对类器官进行圈选。（B）分析中需摒除的区域以白色象征（箭头所示），该区域为类器官腔体，内含部分死细胞，后续分析中将赐与剔除。（C）分析后的图像炫耀总计分割后的细胞核：Hoechst33342阳性核象征为蓝色，EdU阳性核象征为黄色，未达到15 µm2的细胞核分别用绿色（Hoechst33342）和橙色（EdU）标注。比例尺=50微米。

最终定量分析EdU+信号占总DNA量的百分比（图4）。推敲发现，尖端向外类器官的增殖水平显贵低于基底向外类器官。

图4 类器官增殖速度分析。以EdU阳性DNA占总DNA的百分比动作类器官增殖速度的表征辩论，限定炫耀基底向外类器官的增殖活性显贵高于尖端向外类器官。

试验方法

类器官培养

1. 将成东说念骨干细胞着手的肠类器官包埋于基底膜索要物（BME）中，接种于24孔板，使用玻璃移液管进行机械传代。

注：在本试验有计算中，使用了Geltrex动作BME。

2. 防范吸除包埋类器官的优化培养基。

3. 每孔加入500 µL 0.05%胰卵白酶-EDTA，吸吹将总计基质圆顶从孔平分离。将类器官升沉至15 mL离心管，充分重悬以绝对解离水凝胶基质。

4. 将类器官与0.05%胰卵白酶-EDTA于37℃水浴中孵育，直至实足解离为单细胞或小细胞团。

5. 用基础培养基稀释胰卵白酶/细胞悬液，基础培养基体积至少为胰酶的2倍。

6. 420 g、8℃离心5分钟，尽量去除上清。

7. 将细胞再行包埋于BME中，接种至与方法1一样数目的孔板，并补充优化培养基。

8. 于细胞培养箱中孵育3天，随后进行方法2的操作。

极性回转指导与EdU象征

1. 防范吸除BME包埋类器官中的培养基。

2. 每孔加入500 µL的类器官成绩溶液，并通过反复吸吹将总计基质圆顶从孔平分离。将类器官升沉到15 mL离心管中，并充分重悬以实足分离水凝胶基质。

3. 将15 mL离心管置于冰上孵育1.5小时。每隔10分钟充分摇晃试管，以防护类器官聚合并确保剩余水凝胶因素均匀分离。

4. 孵育时间，用抗粘附溶液包被96孔板。按24孔板每孔对应8孔96孔板的比例进行包被，室温孵育至少1小时。

5. 向15 mL管中加入至少两倍于类器官成绩溶液体积的PBS，并在8℃下以150 g离心5分钟。

6. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的PBS中。

7. 将500 µL的类器官/PBS悬浮液升沉到另一个15 mL离心管中，并再次8℃下以150 g离心5分钟。

8. 弃去96孔板中的抗粘附溶液。

9. 离心后，尽可能移除上清液。

10. 使用一个试管用于生成悬浮培养的基底向外（BO）类器官，另一个试管用于尖端向外（AO）类器官。

11. 关于BO类器官，在一个试管中，向96孔板的每个孔中加入100 µL含有7.5% BME的精制培养基。充分搀杂，并将类器官均匀漫衍到预包被的96孔板的所需孔数中。

12. 关于AO类器官，在另一个试管中，向96孔板的每个孔中加入100 µL不含BME的鄙俗精制培养基。充分搀杂，并将类器官均匀漫衍到预包被的96孔板的所需孔数中。

13. 在37°C和5% CO₂下孵育类器官3天。

注：形状学各别将在第1天后初始清醒。但是，先前发表的限定标明，疏漏需要3天时刻，大无数类器官智商呈现出尖端外极性。

14. 在指导极性回转后的特定时刻点，向总计待象征的类器官孔中加入50 µL稀释在精制培养基中的3 µM EdU，使每个孔的最终浓度达到1 µM EdU。

15. 在37°C和5% CO₂下孵育1.5小时。

16. 使用宽口径吸头网罗EdU象征的类器官，并将其升沉到15 mL离心管中。

17. 向每个试管（BO和AO类器官）中加入等量的4% PFA（最终浓度为2% PFA），并防范搀杂。

18. 在室温下孵育15分钟。

19. 向15 mL管中加入至少两倍于管内体积的PBS，并在8℃下以150 g离心5分钟。

20. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的PBS中。

21. 再次在8℃下以150 g离心5分钟。

22. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的PBS中，并将其升沉到1.5 mL离心管中。将类器官保存在4℃，直至进行EdU染色响应

23. 重叠方法14-22，以分析每个时刻点。

Click-it EdU染色响应和Hoechst 33342染色

1. 在4℃下，以50 g离心固定后的类器官5分钟。

2. 移除上清液，使用宽口径吸头将类器官重悬于1 mL的3%牛血白皙卵白（BSA）溶液中（用PBS稀释）。

3. 重叠方法1和2。

4. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的0.5% Triton X-100溶液中（用PBS稀释）。

5. 在室温下孵育20分钟。

6. 在室温下以50 g离心类器官5分钟。

7. 在一个新的试管中，通过搀杂45 µL的水和5 µL的10x Buffer Additive来准备1x Buffer Additive。

8. 在另一个试管中，通过搀杂以下因素来准备响应搀杂液：385.8 µL的水、43 µL的10x响应缓冲液、20 µL的CuSO₄、1.2 µL的Alexa Fluor 647叠氮化物和50 µL的1x Buffer Additive。

注：这种搀杂液弥漫进行五次染色响应，可把柄需要的染色响应数目进行调遣。

9. 重叠方法1和2两次洗涤。

10. 移除上清液，向每个含有类器官的试管中加入100 µL的响应搀杂液（来自方法8）。

11. 在室温下在暗淡中孵育30分钟。

12. 重叠方法1和2洗涤。

13. 在室温下以50 g离心类器官5分钟。

14. 将类器官重悬于1 mL的10 µg/mL Hoechst 33342溶液中（用PBS稀释）。

15. 在室温下在暗淡中孵育45分钟。

16. 重叠方法1和2洗涤。

17. 在4℃下以50 g离心类器官5分钟。

18. 将类器官培育在合适共聚焦显微镜成像的基底膜索要物（BME）基质中。

19. 在共聚焦显微镜下对类器官进行成像。

半自动图像分析

1. 将共聚焦显微镜图像导入图像分析软件，并界说一个文献夹用于保存分析文献。使用“将图像动作时刻点”选项导入多张图像（包括重叠图像、不同时间点、不同惩处等）。每张图像将被视为一个单独的时刻点，便于在各个图像之间切换。

2. 翻开分析面板，并导入动作补充文献1提供的分析历程（arivis_EdU_pipeline）。

3. 使用“舍弃新对象”器具和象征为“Organoid”的“球体”器具，短处圈出总计分离邃密的类器官。

4. 切换到下一张图像，即下一个时刻点，并不时象征总计图像中的类器官。

5. 关于彼此十分聚合、无法使用“球体”模式分离的类器官，翻开对象列表并激活“Organoid”象征。

6. 不时使用“绘画对象”器具的“多边形”模式手动象征类器官轮廓。

注：在对象列表中，总计类器官刻下王人已象征并分派到特定的时刻点。这些时刻点对应于方法1中导入的图像法例。淌若需要，不错将这些时刻点重定名为与原始图像称呼一致。

7. 在对象列表中，象征总计对象（=类器官），右键单击，然后点击“移除象征”，以移除总计对象的“手动”象征。

8. 在对象列表中停用“Organoid”象征，并使用“绘画对象”器具的“多边形”模式象征总计应从分析中摒除的区域。这些区域可能包括类器官腔内的牺牲细胞或依稀区域，这些区域可能会扰乱分析。

9. 翻开对象列表时，确保总计类器官王人象征为“Organoid”，总计应摒除的区域王人象征为“手动”。

10. 点击左上角的箭头启动分析历程。

注：软件刻下将分割Hoechst33342和EdU通说念中的总计细胞核。此分析历程仅推敲大于15 µm²的分割后的Hoechst33342+和EdU+细胞核（即细胞核区域的面积），以确保摒除可能着手于牺牲细胞的小细胞核。

11. 通过点击“特征列”标签，在对象列表中检讨分析限定。

12. 切换到“主从视图”，在上部面板中选拔“类器官”象征和“第一时刻点”特征。

13. 鄙人部面板中，选拔要炫耀的每个类器官的特征。使用投影（x/y/z）面积（体素）、平均强度#1（EdU通说念）和措施差强度#1。

14. 使用Excel导出功能导出限定（主从敷陈）。

15. 保存分析文献并关闭软件。

类器官增殖率的测定

1. 翻开辟出的“主从敷陈”文献。

2. 每个分析的图像王人有一个单独的标签页。

计较每个图像中细胞核和EdU染色的面积/体素总数。

然后，将总计限定数据复制到一个新的汇总标签页中，并将总计属于归拢时刻点的数据分组。

3. 然后，计较每个图像中细胞核的总面积（即Hoechst33342+面积和EdU+面积的总数）。

4. 接下来，将总面积除以自己（=100%），并将平均EdU+面积除以总面积（=EdU+DNA的百分比）。

5. 在y轴上绘画BO和AO类器官的增殖性DNA的百分比，在X轴上绘画不同的时刻点。

小结

本推敲得胜诞生了尖端向外肠说念类器官的培养方法，并通过EdU象征和半自动图像分析时期评估了其细胞增殖率。推敲限定标明，尖端向外类器官的细胞增殖率显贵低于基底向外类器官，这可能是由于极性回转后细胞牺牲率加多所致。

尽管尖端向外类器官在细胞增殖方面存在局限性，但它们为推敲细胞尖端名义的功能提供了新的器具，绝顶是在代谢推敲和感染性疾病推敲中具有进犯应用出路。

基础培养基与优化培养基配方

参考文献

Csukovich G, Wagner M, Schmidhofer K世博体育app下载, Pratscher B, Burgener IA. Generation of Apical-Out Intestinal Organoids and Assessment of Organoid Proliferation Rate Using EdU-Labeling. J Vis Exp. 2025 Mar 28;(217). doi: 10.3791/68039.

发布于：江苏省